hPSCコロニー内の細胞数と増殖率を非剥離で正確に測定し培養条件を評価

hPSCコロニー内の細胞数と増殖率を非剥離で正確に測定し培養条件を評価

ポイント

培養中におけるシングルセル状態からコロニー状態までの様々な増殖状態のhPSCヒトiPS細胞及びES細胞)に関して、位相差画像から正確に細胞数を計測します。

概要

hPSCの細胞増殖速度の測定は、細胞の品質を評価する上で重要です。また、一律の培養条件を維持管理するためにも、継代時において播種濃度を調整するために継代時の細胞数を把握することは重要です。

課題

課題
コロニー内の細胞数を計測する方法が少ない

hPSCはコロニーを形成して増殖します。また、コロニー内の細胞の形態は播種直後から培養時間が経過するに従い変化し、見た目だけでは細胞がどのくらい増殖しているかどうかを判断することは困難です。従って継代時には、十分な播種濃度が得られるほどの細胞数に達しているかを明確に判断できないまま作業に入らざるを得ないのが現状です。

課題
増殖速度測定ができない

細胞の増殖速度を計測する場合は、同じ培養容器内の細胞数を一定期間に等間隔で測定し続けることが理想的です。しかし細胞を回収・分散させて計測する方法は破壊検査であるため、同等の播種条件のサンプルを多数準備し、測定ごとに破壊しながら計測する必要があり、サンプル数確保の制約などの課題が生じます。

ソリューション

培養中におけるシングルセル状態からコロニー状態までの様々な増殖状態のhPSCに関して、位相差画像から正確に細胞数を計測します。培養中のhPSCを撮影し、画像解析により細胞数を計測します。計測時には、粗と密のコロニー状態ごとに作成した細胞数算出式(事前に核染色を行って作成)を用います。
インキュベータに顕微鏡とカメラが内蔵された細胞培養観察装置「BioStation CT」またはインキュベータ内に設置した細胞観察装置「BioStudio-T」を用いることにより、細胞に培養環境変化の影響を与えず、培養容器全体の高解像度タイリング自動撮影が可能です。画像解析ソフトウェア「Cell Analysisモジュール」の製品情報はこちら細胞培養観察装置「BioStation CT」の製品情報はこちら細胞観察装置「BioStudio-T」の製品情報はこちら

iPS細胞コロニーの位相差画像(上)、画像解析によるコロニー粗密判定(下)

iPS細胞コロニーの位相差画像(上)、画像解析によるコロニー粗密判定(下)。
個々のコロニー内の細胞数を正確に計測するため、コロニー粗密判定を行い、粗(青マスク)、密(黄マスク)と判定。さらに、それぞれのコロニー面積に対する細胞数を予め測定した算出式により、細胞数を算出。
Stem Cells Transl Med. 2015;4 (7):720-30. Fig.S4 より改訂)(独立行政法人 新エネルギー・産業技術総合開発機構(NEDO)の委託業務の結果、得られた成果を(一部)活用しています。)

非侵襲的画像解析によりヒトiPS細胞コロニーから細胞数を計測し作成した細胞増殖曲線のグラフ

非侵襲的画像解析によりヒトiPS細胞コロニーから細胞数を計測し作成した細胞増殖曲線

活用シーン

細胞培養の継代時の細胞播種濃度調整に
培養プロセス構築のための評価指標に

  • 培養条件の妥当性検証(培地組成、継代方法、作業者間の手技のばらつきなど)
  • 培養環境の妥当性検証(温度、酸素濃度など)
  • 細胞株間の増殖性の比較

出典

Stem Cells Transl Med. 2015;4 (7):720-30

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